使用 Lumicounter 的抗氧化作用測量方法

通過呼吸作用進入體內的大約 3% 的氧氣在電子傳遞鏈的能量代謝過程中被還原為超氧陰離子 (O2-)、過氧化氫 (H2O2)、羥基自由基 (.OH) 和單線態氧 (1O2) 和其他活性氧。已經指出，這些活性氧使蛋白質變性并破壞DNA中的抗癌基因，從而引起癌變。

另一方面，人體有清除活性和抗氧化物質，如抗壞血酸和α-生育酚等，如超氧化物歧化酶（SOD）氧可將氧氣清除。近年來，尋找具有抗氧化能力的物質，如兒茶素和異黃酮等多酚類物質，以及作為它們的輔助物質的物質受到關注，并且正在進行對其能力的分析。在這里，我們總結了使用化學發光測量自由基清除能力的方法作為抗氧化能力的測量方法。

圖1　活性氧的產生與去除

原則

化學發光法

化學發光是由發光底物的氧化引起的。使用金屬離子或鐵等絡合物作為催化劑，魯米諾被 H2O2 氧化，形成 3-氨基鄰苯二甲酸。此時首先成為激發單重態，成為基態后發出藍色光。

魯米諾反應

抗氧化能力評價

通過測量發光底物的目標物質對發光的氧化抑制，可以測量目標物質的抗氧化能力。作為抗氧化能力的指標，有一種方法可以檢查酶反應產生的自由基的自由基清除能力。另外，在ESR（電子自旋共振）方法中，產生的自由基被DMPO捕獲并測量為自由基強度。因此，間接追蹤超氧化物的消除，而發光測量直接測量活性氧裂解時產生的發光，因此可以說是一種更直接的測量方法。

次黃嘌-黃嘌氧化酶-O2-的底物，是酶促反應產生的一種活性氧，用魯米諾、光澤精或Cypridina熒光素衍生物等使之發光，用發光量計測定發光量。發光計數器。此時計算抑制率（抑制率（%）=1-B/A×100），其中A為未添加抗氧劑時的發光量，B為添加抗氧劑時的發光量. 可以推斷，抑制率越高，抗氧化效果越高。另外，根據SOD的抑制率，將每單位重量樣品的抑制率換算成等量的SOD，可以進行定量測定。

圖2 抗氧化作用測量原理

次黃嘌0-黃嘌0氧化酶系統中的 O2- 產生

抗氧化能力測定例

O2- 由次黃嘌0-黃嘌0氧化酶反應產生，并使用發光試劑發光。添加抗氧化劑作為樣品并獲得抑制率。

■ 試劑

• KH2PO4 緩沖液 (0.1M-KH2PO4-0.05mM-EDTA)

• 次黃嘌0溶液（3.6mM-次黃嘌0/KH2PO4 緩沖液）

• 黃嘌0氧化酶溶液（100μg/mL-黃嘌0氧化酶溶液）

• 發光試劑

■ 測量

使用 Lumicounter 進行測量。由于是高靈敏度的微弱光測量儀，請避開窗戶等有直射光的地方，并注意濕度。NU-700 可以在微型管中進行測量。此外，NU-2500具有攪拌功能，通過每隔一定時間反轉并稍微偏離旋轉軸中心的攪拌裝置，即可有效攪拌樣品。

圖 3 Lumicounter NU-2500

(A)未添加抗氧化劑的微管

• 發光試劑

• 黃嘌0氧化酶溶液

• KH2PO4緩沖劑

被分配并設置在設備中。從自動移液器中分裝黃嘌0溶液并測量積分發光值一分鐘。

(B)添加到微管中的抗氧化劑

• 發光試劑

• 抗氧化劑

• 黃嘌0氧化酶溶液

• KH2PO4緩沖劑

被分配并設置在設備中。從自動移液器中分裝黃嘌0溶液并測量積分發光值一分鐘。

應用領域

抗氧化能力測量和活性氧測量用于以下領域。

• 新型功能性食品的研發
  水稻過氧化物酶活性的測定 稗子中 自由基
  清除成分的測定
  過氧化氫對發芽 生根的影響
  
  

• 醫學領域
  活性氧在體內作用機制的闡明
  體內氧化應激
  的測量 灌注系統中NO的測量 肝損傷
  枯否細胞 的活性氧生產能力
  
  

• 分析化學
  發光試劑的開發
  測量方法的開發
  分子探針的開發

• 其他
  光催化反應產生的活性氧的測量
  魚類中性粒細胞活性氧產生能力的比較魚種間牛乳腺炎
  化學發光早期診斷

除了測量活性氧之外， Lumicounter還可用于多種用途，例如以下用途。

• 使用報告基因的分析使用
  報告基因的基因轉錄和表達功能分析（啟動子、增強子等的活性分析）
  

  1. 熒光素酶測定
  2. 使用磷酸酶
  進行分析 3. 使用 β-半乳糖苷酶進行分析

• 通過 ATP 測量測量細菌和細胞計數
  

  1. 食品、廢水、土壤等中生物量的測量
  2. 食品工業工作場所的衛生檢查
  3.通過測量細胞中的ATP來調查細胞活性
  4. 細菌和酵母等微生物的細胞計數測量
  5.種子、植物生長率測定等

• NAD(P)H系統發光信號的測量與分析
  來自發光細菌的熒光素酶在存在下催化還原的黃素單核苷酸和6-8個碳鏈的長鏈醛氧化成長鏈脂肪酸的反應酶。發光發生。

  1. NAD(P)H 定量
  2. FMN 定量
  3. 酶聯免疫分析

• 應用化學發光
  魯米諾、光澤精等化學發光。

  1.化學發光法檢測吞噬活性2.
  水母蛋白測定Ca2+濃度3.化學
  發光法定量Ach（乙酰膽堿）等